TPHA (Treponema Pallidum Hemagglutination) е индиректен хемаглутинационен тест за качествено и количествено определяне на специфични анти -Treponema Pallidum антитела в човешки серум. Стабилизирани птичи еритроцити в антигенен разтвор на Т. Pallidum, аглутинират в присъствието на анти - Т. Pallidum антитела до образуването на характерна структура, по която се извършва отчитането на резултата. Чувствителността на реактивите е калибрирана срещу 1-ви Международен Стандарт за сифилитичен серум (СЗО).

• Чувствителност: 99,5 %
• Специфичност: 100 %

Клинично значение: Сифилисът е венерическо заболяване, причинено от инфектиране с Т. Pallidum. Предаването на Т. Pallidum става чрез директен контакт и води до формирането на лезии. Инкубационният период е около 20 дни и заболяването протича през 3 стадия с различна симптоматика. Анти - Т. Pallidum антителата се образуват през първия стадий и могат да запазят присъствието си при 85 – 90% от третираните пациенти, дори и след тяхното излекуване.

Реактиви включени в една опаковка:

• Реагент 1: Стабилизирани птичи еритроцити, покрити с Т. Pallidum (Nichols) антигени, Натриев азид 0.95 g/l, pH 7.2
• Реагент 2: Стабилизирана суспензия от птичи еритроцити, Натриев азид 0.95 g/l, pH 7.2
• Реагент 3: Фосфатен буфер pH 7.2, Т. Pallidum (Reiter) екстракт, Натриев азид 0.95 g/l
• Положителна контрола (+) Червена капачка: Човешки серум , предварително разреден 1:20, Натриев азид 0.95 g/l
• Отрицателна контрола (-) Синя капачка: Заешки серум, Натриев азид 0.95 g/l

Необходимо допълнително оборудване: U –дънни микротитърни плаки

Процедура за качествено определяне:

1. Оставете реактивите и пробите да достигнат стайна температура.

2. Разредете серума в съотношение 1:20 с Дилуент (10 µL серум + 190 µL дилуент).

3. Пипетирайте в съседни ямки на микротитърната плака:

• Проба, разредена 1:20 / Контролa (µL) - 25 / 25
• Контролa 75 µL / 0
• Проба - 0 / 75 µL

4. Разбърквайте старателно реакционната смес, чрез разклащане на микроплаката, до пълна хомогенизация.

5. Покрийте микроплаката и инкубирайте на стайна температура за 45 – 60 минути

6. Отчетете визуално получената аглутинационна структура на клетките.

Процедура за полуколичествено определяне:

1. Направете серия двойни разреждания на предварително разредената 1:20 проба с дилуент.

2. Отчетете всяко разреждане по указаната по-горе методика за качествено определяне.

Отчитане и интерпретиране на резултатите: Отчетете резултатите, сравнявайки аглутинационната структура на тестовите клетки и контролните клетки. Отчитането се извършва съгласно следните критерии:

• Равен слой клетки, покриващ изцяло дъното на ямката, понякога с прегънати краища; 4+; Реактивен
• Равен слой клетки, покриващ част от дъното на ямката; 3+; Реактивен
• Равен слой клетки, обграден от червен кръг; 2+; Реактивен
• Равен слой клетки, покриващ малка част от дъното на ямката и обграден от по-малък червен кръг; 1+; Реактивен
• Струпване от клетки с малка дупка в средата; ±; Гранична стойност
• Компактно струпване от неаглутинирали клетки, понякога с много малка дупка в средата; - Негативен

Отрицателният контрол не трябва да аглутинира нито с тестовите, нито с контролните клетки. Положителният контрол трябва да аглутинира само с тестовите клетки. Всяка аглутинация на контролните клетки е индикатор за присъствие на не-специфични антитела и резултатът не може да бъде интерпретиран. Пробите, отчетени като гранични, трябва да бъдат тествани отново и отчетени като негативни при получаване на същия резултат. Реактивните проби трябва да бъдат титрувани съгласно полуколичествената процедура. Титърът, при полуколичествения метод, се определя от най-високото разреждане, дало положителен резултат. Клиничното диагностициране не трябва да се основава само на резултата от един тест, а на интерпретиране както на клиничните, така и на лабораторните данни.

Качествен контрол: Положителният и отрицателният контрол се препоръчват за проверка изпълнението на процедурата, а също така и като сравнителен образец за по-добра интерпретация на резултатите.